Timotej se narodil v Lystře (asi 200km na severozápad od Tarsu) z židovské matky a pohanského otce (srov. Sk 16,1). Skutečnost, že matka uzavřela smíšené manželství a nedala syna obřezat připouští domněnku, že Timotej vyrůstal v rodině, která nebyla přísně praktikující, přestože je o něm řečeno, že Písma znal již od dětství (srov. 2 Tim 3,15). Dochovalo se nám jméno matky, Euniké, a také jméno babičky Lois (srov. 2 Tim 1,5). Když Pavel procházel Lystrou na začátku druhé misijní cesty, vybral si Timoteje, aby jej doprovázel, „protože měl u bratří v Lystře a v Ikóniu dobrou pověst“ (Sk 16,2), ale nechal jej obřezat „z ohledu na tamější židy“ (Sk 16,3). Spolu s Pavlem a Silou, Timotej prošel Malou Asii až do Troady, odkud přešel do Makedonie. Kromě toho jsme informováni o tom, jak ve Filipi Timotej vyvázl, když byli Pavel a Sila obviněni z narušování veřejného pořádku a uvězněni, protože učinili přítrž vykořisťování jedné dívky, jejíhož věštění někteří jedinci bezostyšně využívali (srov. Sk 16,16-40). Když pak byl Pavel nucen odejít do Athén, Timotej jej tam dostihl a odtamtud byl poslán k mladé Církvi do Soluně, aby od ní přinesl zprávy a utvrdil ji ve víře (srov. 1 Sol 3,1-2). V Korintě se pak opět setkal s Apoštolem, předal mu dobré zprávy o Soluňanech a spolupracoval tam s ním při evangelizaci města (srov. 2 Kor 1,19).
Timoteje pak nalézáme v Efesu během třetí Pavlovy misijní cesty. Apoštol odtud pravděpodobně napsal Filemonovi a Filipanům a v obou listech uvádí Timoteje jako spolu-odesílatele (srov. Flm 1; Flp 1,1). Z Efesu jej Pavel poslal do Makedonie spolu s jistým Erastem (srov. Sk 19,22) a pak také do Korintu s pověřením doručit tam list, ve kterém Korinťanům doporučuje, aby jej dobře přijali (srov. 1 Kor 4,17; 16,10-11). Nacházíme jej pak znovu jako spolu-odesílatele Druhého listu Korinťanům a posléze, když z Korintu Pavel píše List Římanům připojuje ke svému pozdravu mimo jiné také Timotejův pozdrav (srov. Řím 16,21). Z Korintu se tento učedník vydal do Troady na břehu Egejského moře a tam očekával Apoštola směřujícího do Jeruzaléma zakončit svou třetí misijní cestu (srov. Sk 20,4). Od této chvíle o Timotejově životě antické prameny nepodávají nic než zmínku v Listě Židům, kde čteme: „Oznamujeme vám, že náš bratr Timotej byl propuštěn. Přijde-li brzo, uvidím vás spolu s ním“ (13,23). Můžeme na závěr říci, že postava Timoteje vystupuje do popředí jako postava velkého pastýře. Podle pozdějších Eusebiových Církevních dějin byl Timotej prvním biskupem Efesu (srov. 3,4). Některé jeho ostatky se od roku 1239 nacházejí v Itálii v katedrále Termoli v Molise a pocházejí z Konstantinopole.